核糖核酸

RNA,核糖核酸的縮寫,即Ribonucleic Acid)的縮寫,存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。由至少幾十個核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵連接而成的一類核酸,因含核糖而得名,簡稱RNA。RNA普遍存在于動物、植物、微生物及某些病毒和噬菌體內。RNA和蛋白質生物合成有密切的關系。在RNA病毒和噬菌體內,RNA是遺傳信息的載體。RNA一般是單鏈線形分子;也有雙鏈的如呼腸孤病毒RNA;環狀單鏈的如類病毒RNA;1983年還發現了有支鏈的RNA分子。

中文名稱 :核糖核酸
所屬部位 :其他
所屬科室 :檢驗科,病理科

1、RNA-簡介

(縮寫為RNA,即Ribonucleic Acid),存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。

RNA由核糖核苷酸經磷酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和堿基構成。RNA的堿基主要有4種,即A腺嘌呤,G鳥嘌呤,C胞嘧啶,U尿嘧啶。其中,U(尿嘧啶)取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成為RNA的特征堿基。

與DNA不同,RNA一般為單鏈長分子,不形成雙螺旋結構,但是很多RNA也需要通過堿基配對原則形成一定的二級結構乃至三級結構來行使生物學功能。RNA的堿基配對規則基本和DNA相同,不過除了A-U、G-C配對外,G-U也可以配對。

在細胞中,根據結構功能的不同,RNA主要分三類,即tRNA(轉運RNA), rRNA(核糖體RNA), mRNA(信使RNA)。mRNA是合成蛋白質的模板,內容按照細胞核中的DNA所轉錄;tRNA是mRNA上堿基序列(即遺傳密碼子)的識別者和氨基酸的轉運者;rRNA是組成核糖體的組分,是蛋白質合成的工作場所。

在病毒方面,很多病毒只以RNA作為其唯一的遺傳信息載體(有別于細胞生物普遍用雙鏈DNA作載體)。

1956彩票1982年以來,研究表明,不少RNA,如I、II型內含子,RNAse P,HDV,核糖體大亞基RNA等等有催化生化反應過程的活性,即具有酶的活性,這類RNA被稱為核酶(ribozyme)。

20世紀90年代以來,又發現了RNAi(RNA interference,RNA干擾)等等現象,證明RNA在基因表達調控中起到重要作用。

在RNA病毒中,RNA是遺傳物質,植物病毒總是含RNA。近些年在植物中陸續發現一些比病毒還小得多的浸染性致病因子,叫做類病毒。類病毒是不含蛋白質的閉環單鏈RNA分子,此外,真核細胞中還有兩類RNA,即不均一核RNA(hnRNA)和小核RNA(snRNA)。hnRNA是mRNA的前體;snRNA參與hnRNA的剪接(一種加工過程)。自1965年酵母丙氨酸tRNA的堿基序列確定以后,RNA序列測定方法不斷得到改進。目前除多種tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等較小的RNA外,尚有一些病毒RNA、mRNA及較大RNA的一級結構測定已完成,如噬菌體MS2RNA含3569個核苷酸。

核糖核酸

Ribonucleic Acid (RNA)

本品能促進肝細胞蛋白質合成,改善氨基酸代謝,降低血清谷丙轉氨酶,改善肝炎患者血清蛋白電泳,并能調節人體免疫功能,促使病變肝細胞恢復正常。臨床用于急慢性肝炎肝硬化的治療。肌內注射,6mg/次,以生理鹽水稀釋,隔日1次,3個月為1療程。

2、RNA-結構分析

1965年R.W.霍利等測定了第 1個核酸──酵母丙氨酸轉移核糖核酸的一級結構即核苷酸的排列順序。此后,RNA一級結構的測定有了迅速的發展。到1983年,不同來源和接受不同氨基酸的tRNA已經弄清楚一級結構的超過280種,5S RNA 175種,5.8S RNA也有幾十種,以及許多16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA和26S rRNA。在mRNA中,如哺乳類珠蛋白mRNA、雞卵清蛋白mRNA和許多蛋白質激素和酶的mRNA等也弄清楚了。此外還測定了一些小分子RNA如sn RNA和病毒感染后產生的RNA的核苷酸排列順序。類病毒RNA也有5種已知其一級結構,都是環狀單鏈。MJS2RNA、煙草花葉病毒 RNA、小兒麻痹癥病毒RNA是已知結構中比較大的RNA。

除一級結構外,RNA分子中還有以氫鍵聯接堿基(A對U;G對C)形成的二級結構。RNA的三級結構,其中研究得最清楚的是tRNA,1974年用X射線衍射研究酵母苯丙氨酸tRNA的晶體,已確定它的立體結構呈倒L形(見轉移核糖核酸)。

RNA 一級結構的測定常利用一些具有堿基專一性的工具酶,將RNA降解成寡核苷酸,然后根據兩種(或更多)不同工具酶交叉分解的結果,測出重疊部分,來決定RNA的一級結構。舉例如下:

AGUCGGUAG

核糖核酸酶 高峰淀粉酶核糖核酸酶T1

(RNAse A) (RNAse T1)

AGU+C+GGU+AG AG+UCG+G+UAG

牛胰核糖核酸酶是一個內切核酸酶,專一地切在嘧啶核苷酸的3′-磷酸和其相鄰核苷酸的5′-羥基之間,所以用它來分解上述AGUCGGUAG9核苷酸,得到AGU、C、GGU和AG4個產物。而核糖核酸酶 T1是一個專一地切在鳥苷酸的3′-磷酸和其相鄰核苷酸的5′-羥基之間的內切核酸酶,它作用于上述9核苷酸,則得到AG、UCG、G和UAG4個產物。根據產物的性質,就可以排列出9核苷酸的一級結構。

除上述兩種核糖核酸酶外,還有黑粉菌核糖核酸酶(RNAse U2),專一地切在腺苷酸和鳥苷酸處,和高峰淀粉酶核糖核酸酶T1聯合使用,可以測定腺苷酸在RNA中的位置。多頭絨孢菌核糖核酸酶(RNAse Phy)除了CpN以外的二核苷酸都能較快地水解,因此和牛胰核糖核酸酶合用可以區別Cp和Up在RNA中的位置。

生物功能和種類 20世紀40年代,人們從細胞化學和紫外光細胞光譜法觀察到凡是 RNA含量豐富的組織中蛋白質的含量也較多,就推測RNA和蛋白質生物合成有關。RNA 參與蛋白質生物合成過程的有 3類:轉運核糖核酸(tRNA)、信使核糖核酸(mRNA)和核糖體核糖核酸(rRNA)。

3、RNA-詳細功能

不同的RNA 有著不同的功能 ,其中rRNA是核糖體的組成成分,由細胞核中的核仁合成,而mRNA tRNA 在蛋白質合成的不同階段分別執行著不同功能。

1956彩票mRNA是以DNA的一條鏈為模板,以堿基互補配對原則,轉錄而形成的一條單鏈,主要功能是實現遺傳信息在蛋白質上的表達,是遺傳信息傳遞過程中的橋梁

tRNA的功能是攜帶符合要求的氨基酸,以連接成肽鏈,再經過加工形成蛋白質

具體請參閱高中生物第二冊,遺傳部分

1956彩票RNA指 ribonucleic acid 核糖核酸

核糖核苷酸聚合而成的沒有分支的長鏈。分子量比DNA小,但在大多數細胞中比DNA豐富。RNA主要有3類,即信使RNA(mRNA),核糖體RNA(rRNA)和轉運RNA(tRNA)。這3類RNA分子都是單鏈,但具有不同的分子量、結構和功能。

在RNA病毒中,RNA是遺傳物質,植物病毒總是含RNA。近些年在植物中陸續發現一些比病毒還小得多的浸染性致病因子,叫做類病毒。類病毒是不含蛋白質的閉環單鏈RNA分子,此外,真核細胞中還有兩類RNA,即不均一核RNA(hnRNA)和小核RNA(snRNA)。hnRNA是mRNA的前體;snRNA參與hnRNA的剪接(一種加工過程)。自1965年酵母丙氨酸tRNA的堿基序列確定以后,RNA序列測定方法不斷得到改進。目前除多種tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA等較小的RNA外,尚有一些病毒RNA、mRNA及較大RNA的一級結構測定已完成,如噬菌體MS2RNA含3569個核苷酸。

4、RNA-種類

在生物體內發現主要有三種不同的RNA分子在基因的表達過程中起重要的作用。它們是信使RNA(messengerRNA,mRNA)、轉運RNA(tranfer RNA,tRNA)、核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)。RNA含有四種基本堿基,即A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶和U尿嘧啶。此外還有幾十種稀有堿基。

RNA的一級結構主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四種核糖核苷酸通過3',5'磷酸二酯鍵相連而成的多聚核苷酸鏈。天然RNA的二級結構,一般并不像DNA那樣都是雙螺旋結構,只有在許多區段可發生自身回折,使部分A-U、G-C堿基配對,從而形成短的不規則的螺旋區。不配對的堿基區膨出形成環,被排斥在雙螺旋之外。RNA中雙螺旋結構的穩定因素,也主要是堿基的堆砌力,其次才是氫鍵。每一段雙螺旋區至少需要4~6對堿基對才能保持穩定。在不同的RNA中,雙螺旋區所占比例不同。【RNA的二級結構】細胞內有三類主要的核糖核酸,即:mRNA、rRNA、tRNA。它們各有特點。在大多數細胞中RNA的含量比DNA多5~8倍。【大腸桿菌RNA的性質】

mRNA

生物的遺傳信息主要貯存于DNA的堿基序列中,但DNA并不直接決定蛋白質的合成。而在真核細胞中,DNA主要貯存于細胞核中的染色體上,而蛋白質的合成場所存在于細胞質中的核糖體上,因此需要有一種中介物質,才能把DNA 上控制蛋白質合成的遺傳信息傳遞給核糖體。現已證明,這種中介物質是一種特殊的RNA。這種RNA起著傳遞遺傳信息的作用,因而稱為信使RNA(messenger RNA,mRNA)。

mRNA的功能就是把DNA上的遺傳信息精確無誤地轉錄下來,然后再由mRNA的堿基順序決定蛋白質的氨基酸順序,完成基因表達過程中的遺傳信息傳遞過程。在真核生物中,轉錄形成的前體RNA中含有大量非編碼序列,大約只有25%序列經加工成為mRNA,最后翻譯為蛋白質。因為這種未經加工的前體mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差別很大,所以通常稱為不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)。

tRNA

如果說mRNA是合成蛋白質的藍圖,則核糖體是合成蛋白質的工廠。但是,合成蛋白質的原材料——20種氨基酸與mRNA的堿基之間缺乏特殊的親和力。因此,必須用一種特殊的RNA——轉運RNA(transfer RNA,tRNA)把氨基酸搬運到核糖體上,tRNA能根據mRNA的遺傳密碼依次準確地將它攜帶的氨基酸連結起來形成多肽鏈。每種氨基酸可與1-4種tRNA相結合,現在已知的tRNA的種類在40 種以上。

tRNA是分子最小的RNA,其分子量平均約為27000(25000-30000),由70到90個核苷酸組成。而且具有稀有堿基的特點,稀有堿基除假尿嘧啶核苷與次黃嘌呤核苷外,主要是甲基化了的嘌呤和嘧啶。這類稀有堿基一般是在轉錄后,經過特殊的修飾而成的。

1969年以來,研究了來自各種不同生物,:如酵母、大腸桿菌、小麥、鼠等十幾種tRNA的結構,證明它們的堿基序列都能折疊成三葉草形二級結構(圖3-23),而且都具有如下的共性:

① 5’末端具有G(大部分)或C。

② 3’末端都以ACC的順序終結。

③ 有一個富有鳥嘌呤的環。

④ 有一個反密碼子環,在這一環的頂端有三個暴露的堿基,稱為反密碼子(anticodon).反密碼子可以與mRNA鏈上互補的密碼子配對。

⑤ 有一個胸腺嘧啶環。

rRNA

核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)是組成核糖體的主要成分。核糖體是合成蛋白質的工廠。在大腸桿菌中,rRNA量占細胞總RNA量的75%-85%,而tRNA占15%,mRNA僅占3-5%。

rRNA一般與核糖體蛋白質結合在一起,形成核糖體(ribosome),如果把rRNA從核糖體上除掉,核糖體的結構就會發生塌陷。原核生物的核糖體所含的rRNA有5S、16S及23S三種。S為沉降系數(sedimentation coefficient),當用超速離心測定一個粒子的沉淀速度時,此速度與粒子的大小直徑成比例。5S含有120個核苷酸,16S含有1540個核苷酸,而23S含有2900個核苷酸。而真核生物有4種rRNA,它們分子大小分別是5S、5.8S、18S和28S,分別具有大約120、160、1900和4700個核苷酸。

rRNA是單鏈,它包含不等量的A與U、G與C,但是有廣泛的雙鏈區域。在雙鏈區,堿基因氫鍵相連,表現為發夾式螺旋。

rRNA在蛋白質合成中的功能尚未完全明了。但16 S的rRNA3’端有一段核苷酸序列與mRNA的前導序列是互補的,這可能有助于mRNA與核糖體的結合。

snRNA

除了上述三種主要的RNA外,細胞內還有小核RNA(small nuclearRNA,snRNA)。它是真核生物轉錄后加工過程中RNA剪接體(spilceosome)的主要成分。現在發現有五種snRNA,其長度在哺乳動物中約為100-215個核苷酸。snRNA一直存在于細胞核中,與40種左右的核內蛋白質共同組成RNA剪接體,在RNA轉錄后加工中起重要作用。另外,還有端體酶RNA(telomeraseRNA),它與染色體末端的復制有關;以及反義RNA(antisenseRNA),它參與基因表達的調控。

有的RNA分子還具有生物催化作用。

上述各種RNA分子均為轉錄的產物,mRNA最后翻譯為蛋白質,而rRNA、tRNA及snRNA等并不攜帶翻譯為蛋白質的信息,其終產物就是RNA。

2006諾貝爾醫學獎成果RNA干擾機制解讀

1990年,曾有科學家給矮牽牛花插入一種催生紅色素的基因,希望能夠讓花朵更鮮艷。但意想不到的事發生了:矮牽牛花完全褪色,花瓣變成了白色!科學界對此感到極度困惑。

類似的謎團,直到美國科學家安德魯·法爾和克雷格·梅洛發現RNA(核糖核酸)干擾機制才得到科學的解釋。兩位科學家也正是因為1998年做出的這一發現而榮獲今年的諾貝爾生理學或醫學獎。

根據法爾和梅洛的發現,科學家在矮牽牛花實驗中所觀察到的奇怪現象,其實是因為生物體內某種特定基因“沉默”了。導致基因“沉默”的機制就是RNA干擾機制。

此前,RNA分子只是被當作從DNA(氧核糖核酸)到蛋白質的“中間人”、將遺傳信息從“藍圖”傳到“工人”手中的“信使”。但法爾和梅洛的研究讓人們認識到,RNA作用不可小視,它可以使特定基因開啟、關閉、更活躍或更不活躍,從而影響生物的體型和發育等。

諾貝爾獎評審委員會在評價法爾和梅洛的研究成果時說:“他們的發現能解釋許多令人困惑、相互矛盾的實驗觀察結果,并揭示了控制遺傳信息流動的自然機制。這開啟了一個新的研究領域。”

科學家認為,RNA干擾技術不僅是研究基因功能的一種強大工具,不久的未來,這種技術也許能用來直接從源頭上讓致病基因“沉默”,以治療癌癥甚至艾滋病,在農業上也將大有可為。從這個角度來說,“沉默”真的是金。美國哈佛醫學院研究人員已用動物實驗表明,利用RNA干擾技術可治愈實驗鼠的肝炎

目前,盡管尚有一些難題阻礙著RNA干擾技術的發展,但科學界普遍對這一新興的生物工程技術寄予厚望。這也是諾貝爾獎評審委員會為什么不堅持研究成果要經過數十年實踐驗證的“慣例”,而破格為法爾和梅洛頒獎的原因之一。

諾貝爾生理學或醫學獎評審委員會主席戈蘭·漢松說:“我們為一種基本機制的發現頒獎。這種機制已被全世界的科學家證明是正確的,是給它發個諾貝爾獎的時候了。”

5、RNA干擾(RNAi)

RNAi的定義

1956彩票目前對RNAi (RNA interference)的定義有很多種,不同的資料對其定義的側重點也不盡相同,如果將RNAi看作一種生物學現象,可以有以下定義:① RNAi是由dsRNA介導的由特定酶參與的特異性基因沉默現象,它在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。② RNAi是有dsRNA參與指導的,以外源和內源mRNA為降解目標的轉基因沉默現象。具有核苷酸序列特異性的自我防御機制,是一種當外源基因導入或病毒入侵后,細胞中與轉基因或入侵病毒RNA同源的基因發生共同基因沉默的現象。

1956彩票如果將其作為一門生物技術,則定義為:① RNAi 是指通過反義RNA與正鏈RNA 形成雙鏈RNA 特異性地抑制靶基因的現象,它通過人為地引入與內源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA 和反義RNA) ,從而誘導內源靶基因的mRNA 降解,達到阻止基因表達的目的。② RNAi是指體外人工合成的或體內的雙鏈RNA(dsRNA)在細胞內特異性的將與之同源的 mRNA降解成21nt~23nt 的小片段,使相應的基因沉默。③ RNAi是將與靶基因的mRNA 同源互補的雙鏈RNA(dsRNA ) 導入細胞,能特異性地降解該mRNA ,從而產生相應的功能表型缺失, 屬于轉錄后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。

各種不同定義雖然說法不同,但所描述事實是大體相同的,簡單地可以說,RNAi就是指由RNA介導的基因沉默現象。

最近由于RNA干擾(RNA interference,RNAi)的發現使反義領域的研究增多。這種自然發生的現象最早是在秀麗線蟲中發現的(1),是序列特異性地使轉錄后的基因沉默的有力機制。由于最近兩年在RNAi領域取得的進步,已經有許多這方面的綜述發表(2-4)。RNA干擾是由長的雙鏈RNA分子發動的,該分子可以被Dicer enzyme加工成長度為21-23個核苷酸的RNA(見圖)。RNAseIII蛋白被認為是作為一個二聚體發揮作用,它對雙鏈RNA的兩個鏈都進行切割,酶切的產物3'末端互相重疊。然后這種小的干擾RNA分子(small interfering RNAs,siRNAs)摻入RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC),引導核酸酶降解靶RNA。

這種保守的生化機制可用于研究多種模式生物的基因功能,但是它在哺乳動物細胞中的應用受到阻礙,因為長的雙鏈RNA分子會引起干擾素1956彩票應答。因此Tuschi及其同事表明長度為21nt的siRNA可以特異性的抑制哺乳動物細胞基因表達是一個革命性的突破(5)。這個發現激發了大量利用RNAi技術對哺乳動物細胞的研究,因為與傳統的反義技術比,RNAi的性能明顯較高。

有趣的是,除了短雙鏈RNA,短發夾RNA(short hairpin RNA,shRNA),比如莖環結構在細胞內經過加工后也可以變成siRNA,從而產生RNA干擾(6、7)。這使得構建表達干擾RNA的載體,從而使哺乳動物細胞內基因表達長期沉默成為可能(4、8)。shRNA可以利用RNA聚核酶III啟動子轉錄,在正常情況下,該啟動子是控制小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)U6(6、7、9、10)或者RNAseP的組分H1 RNA(11)轉錄的。另外一種辦法是兩段短RNA分子分別用U6啟動子轉錄出來(6、12、13)。載體介導的siRNA表達使對功能缺失(loss-of-function)表型進行長期分析成為可能。在穩定轉染的細胞內,兩個月后仍可觀察到沉默現象(11)。

1956彩票另外一種延長siRNA抑制基因表達時間的方法是對化學合成的RNA進行核苷酸修飾。盡管未經修飾的短雙鏈RNA在細胞培養物或者體內的穩定性出乎意料的高,然而有些情況下,需要對siRNA的穩定性進行進一步提高。因此,可以在兩條鏈的末端都引入經過修飾的核苷(14)。一個5'端為兩個2'-O-甲基RNA、3'端為4個甲基化核苷的siRNA與序列相同但是未經修飾的siRNA比活性相同,但是在細胞培養物中引起的基因沉默現象的時間延長。然而,增多siRNA中的甲基化核苷,或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導致siRNA活性下降。

RNA干擾在哺乳動物體內的第一個研究是利用快速注射大量生理溶液的方法將一個編碼shRNA的質粒注入老鼠的尾靜脈(15、16)。在大多數器官中,報道基因(編碼于共轉染質粒或者轉基因小鼠上)的表達可以被有效地抑制。另外,Fas基因被作為肝損傷治療相關的內源靶標進行了RNA干擾實驗(17)。注射siRNA之后,小鼠肝細胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保護小鼠免遭由注射競爭性Fas特異抗體引起的爆發性肝炎,82%用siRNA處理的小鼠活過了10天觀察期,而所有的對照小鼠在3天之內死亡。

上述研究中采用的高壓導入技術是一種粗暴的方法,不適于治療用。因此,標準的基因治療所采用的方法被用于RNA干擾。一個反轉錄病毒載體被用于導入siRNA,以抑制人類胰腺腫瘤細胞中的癌基因K-ras等位基因(18)。負調控癌細胞中K-ras基因的表達使得它們在注入無胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成腫瘤的能力。這項研究還表明siRNA的高度特異性,因為只有癌基因K-ras被沉默,而與之只有1個堿基對差異的野生型等位基因并沒有被沉默。另外,當在紋狀區注射表達siRNA的腺病毒之后,轉基因小鼠大腦中GFP基因的表達可以被抑制(19)。β-葡萄糖醛酸苷酶(b-glucoronidase)的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制。有趣的是,具有CMV啟動子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表達元件被用于這個實驗,為設計組織特異性或者可誘導的siRNA載體打開了大門。

總的來說,siRNA的第一個體內實驗已經進行,其他有重要意義的基因有望于很快作為靶標開展研究。至今為止的研究沒有觀察到任何應用siRNA引起的毒性作用,但是在治療人類疾病的臨床試驗開始之前仍需小心,以排除長期使用RNA干擾引起的嚴重副作用。因為用siRNA使基因表達沉默與傳統的反義技術相似,研究者將從十多年來反義技術研究的教訓中獲益,比如需要使用合適的對照以證明基因表達的敲除是特異性的,以及對免疫系統可能引起的意外影響進行詳細分析。

總結

經過長期盛衰沉浮,反義技術近年來得到越來越多的注意。對能夠提高靶表親和性和生物穩定性、降低毒性的修飾核苷的研究取得了重要進展。由于大多數新的DNA類似物不能激活RNAseH,對反義寡核苷酸的設計需要考慮靶mRNA是否需要保留,例如,是改變剪接方式,還是降解靶mRNA(這種情況下應該使用gapmer技術)。可以通過有系統的修飾天然核酶或者通過體外選擇技術獲得具有高催化活性的穩定核酶。一些反義寡核苷酸和核酶已經進入臨床試驗研究,一個反義藥物已經在1998年獲得批準。一個重要的突破是發現短的雙鏈RNA分子可用于哺乳動物細胞中特異性沉默基因表達。這個方法與傳統的反義技術比效率明顯更高,并且一些體內實驗的數據已經發表。因此,反義技術有望廣泛應用于對未知功能基因的研究、藥物靶標的確認和治療。

1956彩票miRNAmicroRNAs(miRNAs)是一種小的,類似于siRNA的分子,由高等真核生物基因組編碼,miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導沉默復合體(RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯。miRNAs在物種進化中相當保守,在植物、動物和真菌中發現的miRNAs只在特定的組織和發育階段表達,miRNA組織特異性和時序性,決定組織和細胞的功能特異性,表明miRNA在細胞生長和發育過程的調節過程中起多種作用。

miRNA原理

miRNA基因通常是在核內由RNA聚合酶II(polII)轉錄的,最初產物為大的具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個核苷酸組成的pre-miRNA。RAN–GTP和exportin 5將pre-miRNA輸送到細胞質中。隨后,另一個核酸酶Dicer將其剪切產生約為22個核苷酸長度的miRNA:miRNA*雙鏈。這種雙鏈很快被引導進入沉默復合體(RISC)復合體中,其中一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復合體中。成熟的miRNA結合到與其互補的mRNA的位點通過堿基配對調控基因表達。

與靶mRNA不完全互補的miRNA在蛋白質翻譯水平上抑制其表達(哺乳動物中比較普遍)。然而,最近也有證據表明,這些miRNA也有可能影響mRNA的穩定性。使用這種機制的miRNA結合位點通常在mRNA的3’端非翻譯區。如果miRNA與靶位點完全互補(或者幾乎完全互補),那么這些miRNA的結合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比較常見)。通過這種機制作用的miRNAs的結合位點通常都在mRNA的編碼區或開放閱讀框中。每個miRNA可以有多個靶基因,而幾個miRNAs也可以調節同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達,也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調控某個基因的表達。隨著miRNA調控基因表達的研究的逐步深入,將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復雜性和復雜的基因表達調控網絡。

目前只有一小部分miRNAs生物學功能得到闡明。這些miRNAs調節了細胞生長,組織分化,因而與生命過程中發育、疾病有關。通過對基因組上miRNA的位點分析,顯示其在發育和疾病中起了非常重要的作用。一系列的研究表明:miRNAs在細胞生長和凋亡,血細胞分化,同源異形盒基因調節,神經元的極性,島素分泌,大腦形態形成,心臟發生,胚胎后期發育等過程中發揮重要作用。例如,miR-273和lys-6編碼的miRNA,參與線蟲的神經系統發育過程;miR-430參與斑馬魚的大腦發育;miR-181控制哺乳動物血細胞分化為B細胞;miR-375調節哺乳動物胰島細胞發育和胰島素分泌;miR-143在脂肪細胞分化起作用;miR-196參與了哺乳動物四肢形成,miR-1與心臟發育有關。另有研究人員發現許多神經系統的miRNAs在大腦皮層培養中受到時序調節,表明其可能控制著區域化的mRNA翻譯。對于新的miRNA基因的分析,可能發現新的參與器官形成、胚胎發育和生長的調節因子,促進對癌癥等人類疾病發病機制的理解。

miRNA特點:

廣泛存在于真核生物中, 是一組不編碼蛋白質的短序列RNA , 它本身不具有開放閱讀框架(ORF) ;

通常的長度為20~24 nt , 但在3′端可以有1~2 個堿基的長度變化;

成熟的miRNA 5′端有一磷酸基團, 3′端為羥基, 這一特點使它與大多數寡核苷酸和功能RNA 的降解片段區別開來;

多數miRNA 還具有高度保守性、時序性和組織特異性。

6、RNA的提取

一、準備試劑:

氯仿,異丙醇,75℅乙醇,無RNAse的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)。

二、操作步驟:

1956彩票1。 勻漿處理:

a。 組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b. 單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定,不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c。 細胞懸液 離心收集細胞,每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol,反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2. 將勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。

3. 可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質,脂肪,多糖或胞外物質(肌肉,植物結節部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5。 每使用1ml TRIzol加入0。2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中,如要分離DNA和蛋白質可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

9。 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘,棄上清。

10。 室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5-10分鐘即可。不要真空離心干燥,過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNAse的水或0。5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反應,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解,-70℃保存。

三、注意事項:

1. 從少量樣品(1-10mg組織或102-104細胞)中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品,沉淀RNA前加5-10μg RNAse-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來,糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成,也不影響PCR反應。

2. 勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3. 分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機,2600×g離心30-60分鐘。

預期產量:1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為:

肝和6-10μg ,腎3-4μg ,骨骼肌和腦組織1-1.5μg ,胎盤1-4μg ,上皮細胞8-15μg ,成纖維細胞5-7μg 。

四、常見問題分析:

1。 得率低:

A。 樣品裂解或勻漿處理不徹底

B. RNA沉淀未完全溶解

2. A260/A280<1.65 :

A. 檢測吸光度時,RNA樣品沒有溶于水,而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

1956彩票B。 樣品勻漿時加的試劑量太少

C。 勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘

1956彩票D. 吸取水相時混入了有機相

E. RNA沉淀未完全溶解。

3。 RNA降解:

A. 組織取出后沒有馬上處理或冷凍

B. 待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

C. 細胞在用酶處理時過度

D. 溶液或離心管未經RNAse去除處理

E. 電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5

4。 DNA污染:

A. 樣品勻漿時加的試劑量太少

B. 樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液

5。 蛋白聚糖和多糖污染:

沉淀RNA的過程中作以下改進可去除這些污染,步驟7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心,按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應在勻漿后離心,并加上以上操作步驟。

圖集
5分排列3-1956彩票 五分排列3-1956彩票 五百万彩票-五百万彩票网站-五百万彩票App 大发pk拾-官网 三分快三-官网 极速PK10-1956彩票