DNA復制

DNA復制是指DNA雙鏈在細胞分裂以前進行的復制過程,復制的結果是一條雙鏈變成兩條一樣的雙鏈(如果復制過程正常的話),每條雙鏈都與原來的雙鏈一樣。這個過程通過半保留復制機制得以順利完成。 DNA復制主要包括引發、延伸、終止三個階段。

中文名稱 :DNA復制
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目錄

1、引發

復制的引發(Priming)階段包括DNA復制起點雙鏈解開,通過轉錄激活步驟合成RNA分子,RNA引物的 合成,DNA聚合酶將第一個氧核苷酸加到引物RNA的3'-OH末端復制引發的關鍵步驟就是前導鏈DNA的合成,一旦前導鏈DNA的聚合作用開始,滯后鏈上的DNA合成也隨著開始,在所有前導鏈開始聚合之前有一必需的步驟就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滯后鏈模板轉錄一短的RNA分子。在有些DNA復制中,(如質粒ColE),該RNA分子經過加式成為DNA復制的引物。但是,在大部分DNA復制中,該RNA分子沒有引物作用。它的作用似乎只是分開兩條DNA鏈,暴露出某些特定序列以便引發體與之結合,在前導鏈模板DNA上開始合成RNA引物,這個過程稱為轉錄激活(transcriptional activation),在前導鏈的復制引發過程中還需要其他一些蛋白質,如大腸桿菌的dnaA蛋白。這兩種蛋白質可以和復制起點處DNA上高度保守的4個9bp長的序列結合,其具體功能尚不清楚。可能是這些蛋白質與DNA復制起點結合后能促進DNA聚合酶Ⅲ復合體的七種蛋白質在復制起點處裝配成有功能的全酶。DNA復制開始時,DNA螺旋酶首先在復制起點處將雙鏈DNA解開,通過轉錄激活合成的RNA分子也起分離兩條DNA鏈的作用,然后單鏈DNA結合蛋白質結合在被解開的鏈上。由復制因子X(n蛋白),復制因子Y(n'蛋白),n"蛋白,i蛋白,dnaB蛋白和dnaC蛋白等6種蛋白質組成的引發前在單鏈DNA結合蛋白的作用下與單鏈DNA結合生成中間物,這是一種前引發過程。引發前體進一步與引物酶(primase)組裝成引發體(primosome)。引發體可以在單鏈DNA上移動,在dnaB亞基的作用下識別DNA復制起點位置。 首先在前導鏈上由引物酶催化合成一段RNA引物,然后,引發體在滯后鏈上沿5'→3'方向不停的移動(這是一種相對移動,也可能是滯后鏈模板在移動,見后),在一定距離上反復合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成岡崎片段使用,引發體中許多蛋白因子的功能尚不清楚。但是,這些成份必須協同工作才能使引發體在滯后鏈上移動,識別合適的引物合成位置,并將核苷酸在引發位置上聚合成RNA引物。由于引發體在滯后鏈模板上的移動方向與其合成引物的方向相反,所以在滯后鏈上所合成的RNA引物非常短,一般只有3-5個核苷酸長。而且,在同一種生物體細胞中這些引物都具有相似的序列,表明引物酶要在DNA滯后鏈模板上比較特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。

為什么需要有RNA引物來引發DNA復制呢?這可能盡量減少DNA復制起始處的突變有關。DNA復制開始處的幾個核苷酸最容易出現差錯,因此,用RNA引物即使出現差錯最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除,提高了DNA復制的準確性。RNA引物形成后,由DNA聚合酶Ⅲ催化將第一個脫氧核苷酸按堿基互補原則加在RNA引物3'-OH端而進入DNA鏈的延伸階段。

2、DNA鏈的延伸

DNA新生鏈的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化,然而,DNA必須由螺旋酶在復制叉處邊移動邊解開雙鏈。這樣就產生了一種拓撲學上的問題:由于DNA的解鏈,在DNA雙鏈區勢必產生正超螺旋,在環狀DNA中更為明顯,當達到一定程度后就會造成復制叉難再繼續前進,從而終止DNA復制。但是,在細胞內DNA復制不會因出現拓撲學問題而停止。有兩種機制可以防止這種現象發生:[1]DNA在生物細胞中本身就是超螺旋,當DNA解鏈而產生正超螺旋時,可以被原來存在的負超螺旋所中和;[2]DNA拓撲異構酶Ⅰ要以打開一條鏈,使正超螺旋狀態轉變成松弛狀態,而DNA拓撲異構酶Ⅱ(旋轉酶)可以在DNA解鏈前方不停地繼續將負超螺旋引入雙鏈DNA。這兩種機制保證了無論是環狀DNA還是開環DNA的復制順利的解鏈,再由DNA聚合酶Ⅲ合成新的DNA鏈。前已述及DNA生長鏈的延伸主要由DNA聚合酶催化,該酶是由7種蛋白質(多肽)組成的聚合體,稱為全酶。全酶中所有亞基對完成DNA復制都是必需的。α亞基具有聚合功能和5'→3'外切酶活性,ε亞基具有3'→5'外切酶活性。另外,全酶中還有ATP分子它是DNA聚合酶Ⅲ催化第一個氧核糖核苷酸連接在RNA引物上所必需的,其他亞基的功能尚不清楚。

在DNA復制叉處要能由兩套DNA聚合酶Ⅲ在同一時間分別進行復制DNA前導鏈和滯后鏈。如果滯后鏈模板環繞DNA聚合酶Ⅲ全酶,并通過DNA聚合酶Ⅲ,然后再折向與未解鏈的雙鏈DNA在同一方向上,則滯后鏈的合成可以和前導鏈的合成在同一方向上進行。

這樣,當DNA聚合酶Ⅲ沿著滯后鏈模板移動時,由特異的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。當合成的DNA鏈到達前一次合成的岡崎片段的位置時,滯后鏈模板及剛合成的岡崎片斷便從DNA聚合酶Ⅲ上釋放出來。這時,由于復制叉繼續向前運動,便產生了又一段單鏈的滯后鏈模板,它重新環繞DNA聚合酶Ⅲ全酶,并通過DNA聚合酶Ⅲ開始合成新的滯后鏈岡崎片段。通過這樣的機制,前導鏈的合成不會超過滯后鏈太多(最后只有一個岡崎片段的長度)。而且,這樣引發體在DNA鏈上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移動。

按上述DNA復制的機制,在復制叉附近,形成了以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發體和螺旋構成的類似核糖體大小的復合體,稱為DNA復制體(replisome)。復制體在DNA前導鏈模板和滯后鏈模板上移動時便合成了連續的DNA前導鏈和由許多岡崎片段組成的滯后鏈。在DNA合成延伸過程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。當岡崎片段形成后,DNA聚合酶Ⅰ通過其5'→3'外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物,同時,利用后一個岡崎片段作為引物由5'→3'合成DNA。最后兩個岡崎片段由DNA連接酶將其接起來,形成完整的DNA滯后鏈。

3、終止

過去認為,DNA一旦復制開始,就會將該DNA分子全部復制完畢,才終止其DNA復制。但最近的實驗表明,在DNA上也存在著復制終止位點,DNA復制將在復制終止位點處終止,并不一定等全部DNA合成完畢。但目前對復制終止位點的結構和功能了解甚少在DNA復制終止階段令人困惑的一個問題是,線性DNA分子兩端是如何完成其復制的?已知DNA復制都要有RNA引物參與。當RNA引物被切除后,中間所遺留的間隙由DNA聚合Ⅰ所填充。但是,在線性分子的兩端以5'→3'為模板的滯后鏈的合成,其末端的RNA引物被切除后是無法被DNA聚合酶所填充的。

在研究T7DNA復制時,這個問題部分地得到了解決。T7DNA兩端的DNA序列區有160bp長的序列完全相同。而且,在T7DNA復制時,產生的子代DNA分子不是一個單位T7DNA長度,而是許多單位長度的T7DNA首尾連接在一起。T7DNA兩個子代DNA分子都會有一個3'端單鏈尾巴,兩個子代DNA的3'端尾巴以互補結合形成兩個單位T7DNA的線性連接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA連接酶連接后,繼續復制便形成四個單位長度的T7DNA分子。這樣復制下去,便可形成多個單位長度的T7DNA分子。這樣的T7DNA分子可以被特異的內切酶切開,用DNA聚合酶填充與親代DNA完全一樣的雙鏈T7DNA分子。

在研究痘病毒復制時,發現了線性DNA分子完成末端復制的第二種方式。痘病毒DNA在兩端都形成發夾環狀結構。DNA復制時,在線性分子中間的一個復制起點開始,雙向進行,將發夾環狀結構變成雙鏈環狀DNA。然后,在發夾的中央將不同DNA鏈切開,使DNA分子變性,雙鏈分開。這樣,在每個分子兩端形成一個單鏈尾端要以自我互補,形成完整的發夾結構,與親代DNA分子一樣。在真核生物染色體線性DNA分子復制時,尚不清楚末端的復制過程是怎樣進行的。也可能像痘病毒那樣形成發夾結構而進行復制。但最近的實驗表明,真核生物染色體末端DNA復制是由一種特殊的酶將一個新的末端DNA序列加在剛剛完成復制的DNA末端。這種機制首先在四膜蟲中發現。該生物細胞的線性DNA分子末端有30-70拷貝的5'TTGGGG3'序列,該細胞中存在一種酶可以將TTGGGG序列加在事先已存在的單鍵DNA末端的TTGGGG序列上。這樣有較長的末端單鏈DNA,可以被引物酶重新引發或其他的酶蛋白引發而合成RNA引物,并由DNA聚合酶將其變成雙鏈DNA。這樣就可以避免其DNA隨著復制的不斷進行而逐漸變短。

1956彩票在環狀DNA的復制的末端終止階段則不存在上述問題。環狀DNA復制到最后,由DNA拓撲異構酶Ⅱ切開雙鏈DNA,將兩個DNA分子分開成為兩個完整的與親代DNA分子一樣的子代DNA。

DNA復制的特點

1.半保留復制:DNA在復制時,以親代DNA的每一股作模板,合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA,每個子代DNA中都含有一股親代DNA鏈,這種現象稱為DNA的半保留復制。DNA以半保留方式進行復制,是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的實驗所證明。

2。有一定的復制起始點:DNA在復制時,需在特定的位點起始,這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段,即復制起始點(復制子)。在原核生物中,復制起始點通常為一個,而在真核生物中則為多個。

3。需要引物(primer):DNA聚合酶必須以一段具有3'端自由羥基(3'-OH)的RNA作為引物,才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小,在原核生物中通常為50~100個核苷酸,而在真核生物中約為10個核苷酸。

4.雙向復制:DNA復制時,以復制起始點為中心,向兩個方向進行復制。但在低等生物中,也可進行單向復制。

5.半不連續復制:由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈,因此兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是不同的。以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在聚合時基本上是連續進行的,這一條鏈被稱為領頭鏈(leading strand)。而以5'→3'方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在聚合時則是不連續的,這條鏈被稱為隨從鏈(lagging strand)。DNA在復制時,由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazaki fragment)。岡崎片段的大小,在原核生物中約為1000~2000個核苷酸,而在真核生物中約為100個核苷酸。

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